CONICYT–FONDECYT POSTDOC 3180614. (2018-2021) Expresión de ficocianina de Gracilaria chilensis y Porphyridium cruentum y obtención de sus variantes de coloración en modelos bacterianos.

CONICYT–FONDECYT POSTDOC 3180614. (2018-2021) Expresión de ficocianina de Gracilaria chilensis y Porphyridium cruentum y obtención de sus variantes de coloración en modelos bacterianos.

CONICYT–FONDECYT POSTDOC 3180614. (2018-2021) Expresión de ficocianina de gracilaria chilensis y porphyridium cruentum y obtención de sus variantes de coloración en modelos bacterianos.

Los ficobilisomas (PBS) son complejos fotosintéticos auxiliares que captan y conducen la energía luminosa hacia los centros fotosintéticos en rodófitas y cianobacterias. Los PBS están principalmente formados por ficobiliproteínas (PBP), proteínas fluorescentes intensamente coloreadas que absorben energía luminosa gracias a la presencia de cromóforos, tetrapirroles de cadena abierta, unidos de manera covalente a residuos de cisteína. Según sus coloraciones se han descrito tres tipos de ficobiliproteínas: Ficoeritrina de intenso color rojo. Ficocianina de color azul-morado y Aloficocianina de color azul turquesa. Las diferencias en los colores dependen del tipo de crómoforo que tiene unido al esqueleto polipeptídico. Las ficobiliproteínas han sido utilizadas como colorantes naturales alimenticios y sondas fluorescentes. Estudios recientes han demostrado que las ficobiliproteínas tienen acción antinflamatoria y antioxidantes. También se han utilizado como sensitizadores de celdas solares. En los últimos años se ha conseguido la expresión in vitro de aloficocianina y ficocianina en Escherichia coli. Bacillus subtilis es una bacteria Gram-positiva la cual se utiliza de manera habitual en la industria farmacéutica y alimentaria en la producción de proteínas, dado que es considerado un organismo GRAS (Generally Regarde as Safe) por la FDA en EE.UU, ya que no produce endotoxinas. Otra característica particular de Bacillus subtilis es que posee la capacidad de secretar proteínas al medio extracelular, facilitando la obtención de la proteína. Actualmente existen variados sistemas de expresión de proteínas diseñados para Bacillus subtilis, los cuales están siendo cada vez más usado de manera rutinaria en los laboratorios de investigación. Es por estas razones que Bacillus subtilis se utiliza como organismo para la producción de proteínas recombinantes a nivel industrial. El objetivo de este proyecto es conjugar las propiedades de las ficobiliproteínas con la inocuidad y la alta capacidad de Bacillus subtilis de producir proteínas recombinantes. Para esto se propone generar un sistema de expresión de ficobiliproteínas de rodófitas con sus respectivos cromóforos en Bacillus subtilis y generar variantes de los colores de estas proteínas cambiando los cromóforos unidos al esqueleto polipeptídico. Esto con el fin de obtener ficobiliproteínas recombinantes para ser utilizadas como colorantes de alimentos. Para lograr este objetivo se utilizará una aproximación similar a la utilizada en la expresión de aloficocianina en Escherichia coli. Primero se generarán dos plásmidos bi-cistrónicos basados en vectores comerciales mediante el uso de enzimas de restricción. El primero de estos vectores bi-cistrónicos incluirán las secuencias codificantes de la subunidades de ficobiliproteínas y de las enzimas encargadas de la síntesis de los cromóforos ficocianobilina y ficoeritrobilina. El segundo vector incluirá la secuencia codificante de las enzimas liasas encargadas de la unión de cromóforos a la proteína. Una vez creados estos vectores se procederá a la transformación de bacterias Bacillus subtilis cepa 1012 y a la posterior estandarización de la expresión utilizando distintas concentraciones de IPTG como agente inductor de la expresión de proteínas. Una vez estandarizada la expresión de las ficobiliproteínas se purificarán mediante cromatografía IMAC y se analizarán mediante SDS-PAGE y Western Blot. Junto a ello se analizarán los espectros de absorción y emisión de fluorescencia.