La Potencialidad de las Macroalgas como Biomateriales Funcionales: Papel Algal Bioactivo con Propiedades Antimicrobianas
En el marco del proyecto “Desarrollo de papeles bioactivos en base a mezclas de pulpa de algas y fibras secundarias” (D11I-1226) financiado por Conicyt a través de su programa Fondef, ejecutado por el GIBMAR del Centro de Biotecnología de la Universidad de Concepción (CB-UdeC) en colaboración con el Laboratorio de Productos Forestales (Depto. de Ingeniería Química, UdeC), junto con las empresas Indugras S.A., Innocon S.A. y Terra Natur S.A., ha logrado un producto para la protección, embalaje y durabilidad de frutas de exportación. Se trata de un papel desarrollado a partir de macroalgas y celulosa el cual posee propiedades bioactivas contra microorganismos complejos de controlar como Botrytis cinerea que afectan a la industria frutícola. Lo anterior constituye un hito en el desarrollo de biomateriales funcionales de origen marino a nivel nacional y mundial, que ofrece una alternativa para mantener la calidad de la fruta fresca y disminuir las pérdidas económicas de esta relevante industria.
Los embalajes
Los embalajes son elementos desechables que tienen por objeto salvaguardar la integridad de los productos durante el transporte hasta el consumidor, es por ello que la elección correcta de estos es un factor clave. El tipo y material de embalaje dependerá del producto a proteger, así como también del lugar de destino, dado que, existen restricciones propias de cada país importador y de sus costos. Es por esta razón que existen numerosos esfuerzos orientados al uso de nuevos materiales y al desarrollo de sistemas más seguros. Los principales materiales para la elaboración de estos productos son derivados de hidrocarburos como termoplásticos, y de la celulosa como papel y cartón. En este sentido, los materiales termoplásticos permiten la elaboración de embalajes versátiles, no obstante, éstos se han visto afectados por la vigencia de políticas medioambientales en pro del reciclaje, la sustentabilidad y elementos biodegradables. Lo anterior, ha generado una ventaja aparente por el uso de embalaje elaborados a partir de celulosa, ya que proviene de fuentes sustentables, per sé son biodegradables y pueden ser reciclados constituyendo fibras secundarias.
La industria frutícola
La comercialización de frutas frescas depende de la prevención de daños durante toda la cadena productiva desde el huerto a la mesa; cosecha, almacenamiento, embalaje, comercialización y transporte (Nunes et al, 2009). Por lo tanto, la mantención de la calidad e integridad de la fruta en la cadena productiva es compleja, ya que las frutas son elementos vivos que respiran, maduran y por consecuencia cambian su composición química. Por esta razón, muchos de los problemas se deben a cambios en las condiciones ambientales al interior de los sistemas de almacenamiento o transporte. Un manejo deficiente de estos factores, puede generar la pudrición de las frutas producto de la proliferación de microorganismos fitopatógenos oportunistas postcosecha. En este sentido los productos de embalaje ofrecen protección contra golpes, raspaduras o aislación térmica, pero no contra los microorganismos, por lo que es necesario el desarrollo de embalajes bioactivos capaces de prevenir la pudrición generada por los microorganismos.
La industria frutícola chilena pierde anualmente entre el 3 y 5 % del total de las exportaciones de fruta fresca debido exclusivamente al ataque de fitopatógenos postcosecha. Si consideramos que las exportaciones chilenas de fruta fresca durante la temporada 2012-2013 fue de 2,7 millones de toneladas equivalentes a USD4.411 millones, las pérdidas son millonarias (Agurto et al, 2014).
Los fitopatógenos
Los principales microorganismos fitopatógenos son hongos tales como Botrytis cinerea, Penicillium expansum, Alternaria alternata y Pezicula malicorticis (Prusky, 2011; Coulomb 2008). El moho gris o B. cinerea es complejo de controlar debido a que tiene la capacidad de crecer al interior de las cajas almacenadas o transportadas a bajas temperaturas y afecta a más de 200 especies de cultivo en el mundo durante el periodo de post-cosecha, incluyendo; uvas, manzanas, peras y frutillas, entre otras (Elad & Shtienberg, 1995). Para el control de este patógeno son empleados agentes químicos sintéticos, tales como: benzimidazoles, ditiocarbamatos, estrobilurinas, guanidinas, imidazoles, piperazinas triforine, pirimidinas, ftalimidas, sulfaminas y triazoles (Njombolwana et al, 2013).
No obstante, el uso de estos compuestos a largo plazo ha generado microorganismos resistentes y daños en el ambiente debido a que por lo general son difíciles de degradar. En respuesta a esto, los países importadores de fruta han establecido límites máximos de residuos químicos en los frutos (Ippolito & Nigro, 2000) lo cual también es una oportunidad para aquellos compuestos de origen natural capaces de hacer frente a estas problemáticas.
Las macroalgas
La búsqueda de nuevos compuestos bioactivos antioxidantes y antimicrobianos ha motivado el estudio de las macroalgas como materia prima, debido a la riqueza química que ellas poseen, las que han demostrado ser una efectiva fuente natural de compuestos contra microorganismos tales como bacterias y hongos (Troncoso et al., 2015a; Felicio et al., 2010). Por otro lado, existen algas como las de los géneros Rhizoclonium y Gracilaria que presentan fibras adecuadas para la manufactura de un papel con las características estructurales tradicionales, pero con nuevas características funcionales basadas en los compuestos biológicamente activos presentes en ellas, es decir, permiten el desarrollo de un papel bioactivo.
El Papel Algal Bioactivo (PAB)
El producto desarrollado por GIBMAR-CBUdeC corresponde a un papel con propiedades biológicamente activas, elaborado a partir de fuentes renovables tales como fibras secundarias de celulosa y macroalgas chilenas (Troncoso et al. 2015b). El producto puede ser utilizado para envolver y con ello proteger a frutas y vegetales contra el estrés oxidativo del aire, el ataque bacteriano y principalmente frente a hongos fitopatógenos, permitiendo la prevención de daños durante su almacenamiento y transporte de la fruta de exportación (Agurto et al, 2014).
Las principales características diferenciadoras sobre otros productos existentes en el mercado son sus propiedades biológicamente activas como lo son la capacidad antioxidante, actividad contra el crecimiento de bacterias tales como Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa y P. syringae, pero por sobre todo destaca en la capacidad para inhibir el crecimiento de los hongos fitopatógenos Botrytis cinerea, Alternaria alternata y Penicillium sp.
Al producir papeles algales bioactivos para proteger frutas y vegetales contra el ataque de microorganismos fitopatógenos o contra el estrés oxidativo presente en el aire, contribuye con dar un uso no tradicional a la biomasa macroalgal, diversificando su matriz económica. Además, el producto en sí promueve el reciclaje al hacer uso de fibras secundarias de celulosa para su elaboración. Finalmente se trata de un material 100% biodegradable que no presenta las restricciones propias de los productos plásticos empleados para dar protección a frutas de exportación.
Verificación de la funcionalidad del Papel Algal Bioactivo
La capacidad antioxidante fue verificada utilizando el método del radical catión ABTS•+ el cual consiste en medir la decoloración del radical a una longitud de onda de 734 nm por medio de un espectrofotómetro. La decoloración fue expresada como el porcentaje de inhibición en función de la concentración y del tiempo de reactividad de Trolox empleado como estándar. Los valores fueron expresados como Capacidad Antioxidante Equivalente a Trolox (TEAC). El Papel Algal Bioactivo (PAB) desarrollado por GIBMAR – CBUdeC presentó un valor TEAC de 0,0378 ± 0,002 μmol de TE g-1 de papel. En contraste al valor obtenido por el Papel Sulfito Frutero (PSF) con un TEAC de 0,0089 ± 0,0007 μmol de TE g-1 (Fig. 1). Estos valores presentan diferencias estadísticamente significativas (ANOVA HSD Tukey p<0,0001) entre el PAB y PSF. Este positivo resultado demuestra que el producto PAB desarrollado es capaz de proteger a frutas y vegetales contra el estrés oxidativo, evitando el posterior asentamiento de microorganismos oportunistas.
Figura 1. Capacidad antioxidante entre el Papel Sulfito Frutero y el Papel Algal Bioactivo expresado como TEAC.
La capacidad antibacteriana fue verificada por medio de un ensayo por discos de difusión en placas Petri con medio de cultivo Mueller-Hinton Agar inoculadas con 100 μL de cultivo bacteriano a 105 UFC mL-1. Luego, fueron dispuestos discos de 6 mm de diámetro obtenidos desde el Papel Algal Bioactivo, discos de Gentamicina (compuesto antibacteriano) empleado como control positivo y discos de Papel Sulfito Frutero como control negativo. Las cepas bacterianas utilizadas fueron: Escherichia coli (K12), Pseudomonas aeruginosa (PA01) y Pseudomonas psyringae (DC300), facilitadas por el Laboratorio de Biopelículas y Microbiología Ambiental del CBUdeC. Finalmente, las placas fueron incubadas aeróbicamente a 37°C ±1°C por 36 horas. Los discos de Papel Sulfito Frutero mostraron una capacidad contra la adherencia bacteriana, pero no una capacidad inhibitoria del crecimiento. Por otro lado, los disco de PAB, presentaron halos de inhibición del crecimiento bacteriano de 8 ± 1,4 mm contra E. coli, de 6,6 ± 0,3 mm contra P. aeruginosa, y de 6,4 ± 0,2 mm contra P. psyringae, todas con diferencias altamente significativas con respecto al PSF (ANOVA HSD Tukey, p< 0,001). Los valores observados en el control con antibiótico fueron notoriamente superiores (20,3 ± 0,8 mm) a los obtenidos por PAB (Fig. 2). A pesar de la gran diferencia, el PAB posee capacidad antibacteriana, si bien es baja respecto del control positivo (gentamicina), es estadísticamente significativa y superior a la lograda por el PSF, por lo tanto, es factible su uso para dar protección a frutas y vegetales susceptibles al ataque de estos patógenos. La capacidad antifúngica fue verificada por medio de un ensayo por discos de difusión en placas Petri con medio de cultivo Agar Papa Dextrosa inoculadas por dispersión empleando tórulas. Luego, fueron dispuestos discos de 6 mm de diámetro obtenidos desde el Papel Algal Bioactivo, discos con Nistatina y discos de Papel Sulfito Frutero como grupos control. Las cepas fúngicas utilizadas fueron: Botrytis cinerea (Bo C12), Penicillium sp. (RGM 902) y Alternaria alternata (RGM 408), facilitadas por el Laboratorio de Patología Forestal (CB-UdeC) y por el Banco de Recursos Genéticos y Microbianos (INIA-Quilamapu). Finalmente, las placas fueron incubadas aeróbicamente a 25°C ±1°C por 6 días. El control realizado con discos de PSF no presentó actividad inhibitoria del crecimiento fúngico, ya que, los discos fueron cubiertos por completo por los hongos. Los valores obtenidos (Fig. 3) demuestran que el PAB posee capacidad antifúngica de 12,5 ± 1,1 mm contra B. cinerea, de 12 ± 1,5 mm contra A. alternata y de 10,4 ± 0,6 mm contra Penicillium sp., por lo tanto, el uso del PAB contra el ataque de estos hongos es factible. Los valores obtenidos por el control positivo Nistatina fueron semejantes a los obtenidos por el PAB con la excepción del valor logrado contra B. cinerea, donde fue estadísticamente superior la actividad de PAB (ANOVA HSD Tukey p<0,001). Este resultado promueve el uso del PAB para conferir protección a frutas y vegetales de manera eficiente.
Figura 2. Comparación del potencial antibacteriano expresado como diámetro de inhibición contra a tres cepas bacterianas empleando Papel Sulfito Frutero, Papel Algal Bioactivo y un control.
Figura 3. Capacidad antifúngica expresada como diámetro de inhibición contra a tres cepas de hongos empleando Papel Sulfito Frutero, Papel Algal Bioactivo y un control.
La validación in vivo del Papel Algal Bioactivo (PAB) consistió en un experimento con 300 manzanas de exportación de la variedad Royal Gala. Las manzanas poseen un peso promedio de 174,6 ± 7,5 gramos, una firmeza de pulpa de 14,6 ± 0,5 lb y un dulzor de 11,4 ± 0,3 °Brix, demostrando que se trata de fruta estándar, madura, lista para consumo y en condiciones propicias para la infección por microorganismos oportunistas. El experimento consistió en la realización de incisiones a cada manzana para facilitar el ingreso de patógenos oportunistas. Luego, fueron dispuestas en bandejas para 25 unidades, constituyendo 3 grupos experimentales. Estos grupos fueron protegidos con Papel Sulfito Frutero, Papel Algal Bioactivo y sin protección (control).
Las cajas fueron almacenadas a 16 ± 1,6 °C por 75 días, controlando cada 15 días. Transcurridos 75 días de incubación el tratamiento más afectado por el desarrollo de microorganismos fitopatógenos fue el protegido por PSF mostrando una pérdida por infección de un 92% de las manzanas bajo este tratamiento. Por otro lado, las manzanas sin protección mostraron una perdida por infección de un 80% del total. Al contrario, las manzanas protegidas por el PAB presentaron el menor nivel de pérdida por infección con un 28% del total de las manzanas (Fig. 4). Los valores observados fueron significativamente diferentes (HSD Tukey, p<0,004) y claramente a favor del uso del Papel Algal Bioactivo desarrollado.
Figura 4. Porcentaje de manzanas (n=300) perdidas producto de la infección ocasionada por patógenos oportunistas, comparando fruta sin protección, con Papel Sulfito Frutero y con Papel Algal Bioactivo. Se destaca significativamente el nivel de protección en la fruta con PAB.
El Control Medio de la Infección (CMI) es definido como el tiempo en que la contaminación de un patógeno afecta al 50% de las manzanas bajo evaluación. En este sentido, los resultados muestran que el CMI para las manzanas sin protección fue de 59 días, ligeramente mayor al obtenido por el tratamiento con PSF con 54 días. En contraste, fue obtenida una CMI de 94 días para las manzanas protegidas con PAB aproximadamente 1,7 veces más duradera que el tiempo de protección observado en los otros casos. Por lo tanto, cuando se pierde el 100% de las manzanas protegidas con PSF o sin protección, las manzanas con PAB aún no llegan al 50% de pérdida.
Finalmente, el producto PAB desarrollado por el Grupo Interdisciplinario de Biotecnología Marina (GIBMAR – CBUdeC) posee la capacidad de proteger eficientemente a especies frutales de exportación, ejemplificado a través del uso de manzanas, contra el ataque de microorganismos patógenos oportunistas, otorgando durabilidad y calidad a la fruta, y reduciendo significativamente las mermas económicas de la industria.
Referencias
Agurto C., N. Troncoso, J. Farias, S. San Martin. 2014. Papeles bioactivos de pulpa de algas y fibras secundarias: Una potencial solución para industria frutícola nacional. Revista Versión Diferente. 21 (2), 120-122.
Coulomb D. 2008. Refrigeration and cold chain serving the global food industry and creating a better future: two key IIR challenges for improved health and environment. Trends in Food Science & Technology. 19, 413-417.
Elad Y: Shtienberg D. 1995. Botrytis cinerea in greenhouse vegetables: chemical, cultural, physiological and biological controls and their integration. Integrated Pest Management Reviews March 1995. 1(1), 15-29.
Everett K. R., S. G. Owen, J. G. M. Cutting. 2005. Testing efficacy of fungicides against postharvest pathogens of avocado (Persea americana cv. Hass). N. Z. Plant Prot. 58, 89-95.
Felicio R, Albuquerque S, Marx MC, Yokaya NS & Debosi HM. 2010. Tripanocida, potencial leishmanicida y antifúngica de alga roja marina Bostrychia tenella J. Agardh (Rhodomelaceae, Ceramiales). Journal of Pharmaceutical y Análisis Biomédica. 52 (5), 763-769.
Ippolito A., Nigro. Franco. 2000. Impact of preharvest application of biological control agents on postharvest diseases of fresh fruits and vegetables. Crop Protection. 19, 715-723.
Njombolwana N. S., A. Erasmus, P. H. Fourie. 2013. Evaluation of curative and protective control of Penicillium digitatum following imazalil application in wax coating. Postharvest Biol. Tec. 77, 102-110.
Nunes M., N. Cecilia, J. P. Emond, M. Rauth, S. Dea , K. V. Chau, 2009. Environmental conditions encountered during typical consumer retail display affect fruit and vegetable quality and waste. Postharvest Biology and Technology. 51, 232–241.
Prusky D. 2011. Reduction of the incidence of postharvest quality losses, and future prospects. Springer Science. Food Sec. 3, 463–474.
Troncoso N., R. Saavedra, A. Olivares, J. Farias, S. San Martin, H. Urrutia, C. Agurto. 2015a. Identificación de compuestos antibacterianos en macroalgas presentes en la Región del Biobío. Revista de Biología Marina y Oceanografía. 50 (1), 199-204.
Troncoso N., S. San Martín, J. Farías, S. Vera, R. Teixeira, M. Pereira, C. Agurto. 2015b. Avances en el desarrollo de biomateriales funcionales: Papel de pulpa algal y fibra secundaria. Revista Versión Diferente. 23(2), 82-84.